Salud de los hombres

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

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No hace mucho tiempo, se desarrolló un método confiable, altamente sensible y rápido para diagnosticar varias enfermedades infecciosas humanas. Este método se llama "análisis de PCR". Qué es, qué es su esencia, qué microorganismos pueden revelar y cómo hacerlo bien, lo diremos en nuestro artículo.

Historia del descubrimiento

El científico estadounidense Carey Mullis en 1983 inventó un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método de diagnóstico de Cetus Corporation, en el que trabajó su creador, se patentó originalmente. Pero en 1992, todos los derechos y patentes se vendieron a Hoffman-La Roche. Después de eso, resultó que estudios similares paralelos se llevaron a cabo y fueron registrados por otros biólogos estadounidenses, como Alice Chan, David Edgar y John Trell. En 1980, los científicos soviéticos A. Slyusarenko, A. Kaledin y S. Gorodetsky también se ocuparon de este problema. Por lo tanto, no fue posible determinar el único titular de los derechos. Muchos eminentes bioquímicos han hecho una contribución definitiva al desarrollo de la metodología de PCR y han patentado sus innovaciones. En este momento, el análisis de PCR se lleva a cabo en cualquier lugar en laboratorios especialmente equipados.

¿Por qué los diagnósticos de PCR tienen tal valor?


Una de las ventajas significativas del método de PCR es la alta sensibilidad: del 95 al 100%. Sin embargo, estos beneficios deben basarse en el cumplimiento indispensable de las siguientes condiciones:

  1. Recogida correcta, transporte de material biológico,
  2. Disponibilidad de instrumentos estériles, desechables, laboratorios especiales y personal capacitado.
  3. Adherencia estricta a los métodos y esterilidad durante el análisis.
La sensibilidad es diferente para diferentes microbios detectables. Por ejemplo, la sensibilidad del método de PCR para detectar el virus de la hepatitis C es del 97-98%, y la sensibilidad para detectar el ureaplasma es del 99-100%.

Las posibilidades inherentes al análisis por PCR, nos permiten alcanzar una especificidad analítica insuperable. Esto significa la identificación del microorganismo que estaba buscando, y no similar o estrechamente relacionado.
La sensibilidad diagnóstica y la especificidad del método de PCR a menudo son superiores a las del método de cultivo, llamado el "estándar de oro" para la detección de enfermedades infecciosas. Dada la duración del cultivo del cultivo (desde varios días hasta varias semanas), la ventaja del método de PCR se hace evidente.

PCR en el diagnóstico de infecciones.
Las ventajas del método de PCR (sensibilidad y especificidad) determinan una amplia gama de aplicaciones en la medicina moderna.
Las principales aplicaciones de los diagnósticos por PCR:

  1. Diagnóstico de enfermedades infecciosas agudas y crónicas de diversas localizaciones.
  2. Monitoreando la efectividad de la terapia.
  3. Especificación del tipo de patógeno.
La PCR se utiliza en obstetricia, ginecología, neonatología, pediatría, urología, venereología, nefrología, clínica de enfermedades infecciosas, oftalmología, neurología, fisisiopulmonología, etc.

El uso de los diagnósticos de PCR se realiza junto con otros métodos de investigación (ELISA, PIF, REEF, etc.). Su combinación y conveniencia es determinada por el médico tratante.

Patógenos infecciosos detectados por PCR

Virus

  1. Retrovirus VIH-1 y VIH-2
  2. virus herpetiformes
  3. virus herpes simplex tipo 1 y 2
  4. citomegalovirus
  5. Virus de epstein-barr
  6. varicela - virus zoster
  7. Herpes virus humanos 6 y 7.
  8. hepatitis C, B y A
  9. virus del papiloma humano
  10. virus de la rubéola
  11. adenovirus
  12. rinovirus
  13. parvovirus
  14. picornovirus

Bacterias:
  1. micobacteria
  2. clamidia
  3. mycoplasma
  4. salmonella
  5. legionella
  6. Clostridiums
  7. treponema pálido
  8. varios tipos patógenos de E. coli
  9. Vibrio cholerae
  10. rickettsia
  11. Staphylococcus aureus
  12. agente bacteriano causante de la meningitis
  13. Helicobacter pylori
  14. ureaplasma
  15. agente causante de la gonorrea
  16. palo de difteria
  17. bacilo hemofilico

Esta lista contiene los agentes infecciosos más comunes detectados por PCR. De hecho, esta lista es mucho más amplia y se actualiza constantemente, a medida que se sintetizan nuevas "semillas". También se debe tener en cuenta que la lista de patógenos identificados está determinada por la presencia de "cebadores" para la identificación en el arsenal de cada laboratorio específico.

¿Cuál es la esencia de la reacción en cadena de la polimerasa?

La investigación en PCR es un logro y un gran logro de la biología molecular. Este es un método que, al detectar micrositios de ADN o ARN de material genético extraño (genoma), es capaz de reconocer las características individuales inherentes a un solo tipo de microorganismo, sin confundirlo con ningún otro. ¿Cómo funciona el método de PCR y cómo se logra restaurar la imagen del comportamiento de una célula infecciosa en un organismo vivo?

Proceso de PCR

Entonces, se encontró un fragmento de ácido nucleico, pero está solo y no es suficiente para llevar a cabo la reacción, por lo tanto, se codifica (copia). Sin embargo, para el proceso adicional, se necesita un gran número de tales microparcelas, que pueden asegurar su reproducción al completar nuevos segmentos de ADN idénticos al fragmento encontrado (replicación). La reproducción es una característica natural e inherente de un ácido nucleico que se replicará usando enzima polimerasa incluso fuera de un organismo vivo (en un tubo de ensayo con una muestra), formando muchos clones, es decir, irá reacción en cadena. Se clonarán todos los fragmentos nuevos y nuevos, pero solo aquellos en los que esté interesado el investigador. Por eso asi Es importante realizar un análisis "puro", sin impurezas, y realizar la prueba con mucho cuidado.

Dadas las capacidades enumeradas de la reacción en cadena de la polimerasa, puede adivinar por qué distingue tan fácilmente el ureaplasma del micoplasma, o cada uno de ellos de la clamidia.

Por lo tanto, incluso si entre los millones de células del cuerpo humano, no se pierde el virus vivo en sí, sino solo una parte de su ADN, entonces la PCR, si nada lo impide, probablemente hará frente a la tarea e informará la presencia del "alienígena" con un resultado positivo. Esta es la esencia de la PCR y su principal ventaja.

Fortalezas y debilidades

El laboratorio que realiza los diagnósticos de PCR tiene los requisitos más altos en términos de equipos, sistemas de prueba y calificaciones del personal médico. Este es un laboratorio de alta tecnología con un arsenal de reactivos altamente sensibles y muy específicos, por lo que no tiene inconvenientes específicos. ¿Es eso lo que da un resultado positivo en ausencia de manifestaciones clínicas y, por lo tanto, pone a la clínica ante el dilema: debo comenzar el tratamiento o no?

El médico, observando al paciente, comienza a dudar de la fiabilidad de los resultados de la prueba, ya que no ve ningún signo de la enfermedad. Pero aun así Dada la alta sensibilidad del sistema de PCR, debe recordarse que detecta el patógeno incluso en la etapa preclínica.Y un resultado positivo en este caso es más ventaja que desventaja. Sobre esta base, el médico tratante debe decidir si la terapia es adecuada, teniendo en cuenta otros pros y contras.

Las ventajas de los diagnósticos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa son obvias:

  • Alta especificidadalcanzar el 100%, debido a la presencia en la muestra de partículas de ácidos nucleicos inherentes a un organismo en particular, pero ajenas al hombre,
  • Alto rendimientoDebido a que la PCR es una técnica automatizada de alta tecnología que brinda la capacidad de realizar pruebas el día de tomar el material y deshacerse del paciente de disturbios innecesarios,
  • PCR, trabajando en una muestra, es capaz de realizar varios estudios y sobredetectar varios agentes patógenos, si va a ser esa tarea. Por ejemplo, en el diagnóstico de infección por clamidia, donde la PCR es uno de los métodos principales, junto con la clamidia, es posible detectar la neisseria (gonococo), el agente causante de la gonorrea. Además, la fiabilidad de los resultados no se ve afectada negativamente,
  • PCR te pruebaMuestra microorganismos peligrosos en el periodo de incubación.cuando no han tenido tiempo de infligir un daño significativo al cuerpo, es decir, el diagnóstico temprano advierte del desarrollo inminente del proceso patológico, lo que hace posible prepararse para él y tomarlo completamente armado.

Además, para evitar malentendidos, que a veces surgen durante el diagnóstico, la PCR se protege a sí misma por el hecho de que sus resultados pueden ser fijos (foto, computadora) con el fin de utilizarlos con fines expertos, si es necesario.

Una respuesta negativa se considera normal en las respuestas de PCR.Al indicar la ausencia de fragmentos de ácidos nucleicos extraños, una respuesta positiva indicará la presencia de infección en el cuerpo, los valores digitales indican el estado del virus y su concentración en el momento de la prueba. Sin embargo, un médico que se ha sometido a un estudio especial sobre el tema de la PCR lleva a cabo una descodificación completa del análisis. Tratar de interpretar los resultados por su cuenta no tiene ningún sentido, ya que es posible, como es probable que suceda, malinterpretar y comenzar a preocuparse de antemano.

¿Qué "teme" el PCR, qué puede hacer y cómo prepararse para ello?

Como en cualquier otro estudio, A veces los resultados de las pruebas resultan ser falsos positivos o falsos negativos.donde PCR no es una excepción. Esto puede suceder en los siguientes casos:

  1. Violaciones del proceso en una etapa de la reacción,
  2. Incumplimiento de las normas de recogida de material, su almacenamiento o transporte,
  3. La presencia de impurezas en el material.

Esto sugiere que el PCR - diagnóstico de infecciones debe abordarse con cuidado, cuidado y cuidado, de lo contrario las muestras del material pueden cambiar su estructura estructural o incluso colapsar.

Etapas del diagnóstico por PCR. Los resultados falsos pueden causar irregularidades en cualquier etapa del estudio.

El diagnóstico por PCR de infecciones pertenece a la categoría de "estándares de oro" entre otros métodos de laboratorio, por lo que se puede utilizar para buscar patógenos de muchas enfermedades que a primera vista no tienen nada en común:

  • Tuberculosis de varias localizaciones, neumonía (incluso atípica, causada por clamidia),
  • Infecciones infantiles (sarampión rubéola, parotitis, sarampión),
  • Difteria
  • Salmonelosis,
  • Enfermedad infecciosa zoonótica - listeriosis (la enfermedad se caracteriza por una variedad de síntomas con daño en los ganglios linfáticos, el sistema nervioso central, los órganos internos),
  • Enfermedades causadas por la penetración del virus de Epstein-Barr (mononucleosis infecciosa, etc.),
  • Patología del cáncer provocada por la infección por VPH (VPH y sus tipos),
  • Borreliosis (enfermedad de Lyme, encefalitis transmitida por garrapatas),
  • Infección por Helicobacter pylori, causada por el microbio humano Helicobacter pylori que vive en el estómago humano. Se ha comprobado que Helicobacter causa cáncer de estómago o duodeno 12,
  • Candidiasis y prácticamente todas las ETS.

El diagnóstico por PCR de las infecciones de transmisión sexual es de particular importancia, ya que las enfermedades causadas de este modo a menudo duran mucho tiempo sin manifestaciones clínicas, pero luego se vuelven más activas durante el embarazo y amenazan la salud e incluso la vida del niño. Las infecciones por TORCH también se comportan de manera similar. Algunos de ellos ("adherentes") se aplican simultáneamente a las ITS, por lo tanto, estos últimos requieren una consideración más detallada. El lector podrá familiarizarse con las técnicas más populares en las siguientes secciones del artículo.

¿Cómo prepararse adecuadamente para obtener un resultado confiable?

Inmediatamente, notamos que la preparación para la PCR es bastante simple, y no requiere un esfuerzo especial por parte del paciente. Solo necesitas completar tres tareas simples:

  1. No tenga relaciones sexuales 24 horas antes de la prueba,
  2. Para la recolección y análisis de sangre de una vena, es necesario que vengas con el estómago vacío, por cierto, también es imposible beber,
  3. Entregue la orina por la noche (por la mañana, en un frasco estéril, comprado el día anterior en la farmacia).

La PCR puede funcionar en cualquier entorno biológico.

El método de PCR no es "sediento de sangre", por lo tanto acepta cualquier medio biológico que contenga el agente infeccioso sospechoso. La elección, lo que debe tomar para la investigación, sigue siendo para el médico.

Por lo tanto, en la búsqueda de un agente patógeno, además de un análisis de sangre (aunque también se ajusta y en la mayoría de los casos se toma en paralelo a otro material), puede utilizar:

  • Frotis (secreción del tracto urogenital),
  • Raspado de las membranas mucosas de la boca, la conjuntiva, la nasofaringe, el tracto genital (las mujeres toman del cuello uterino y la vagina, los hombres, de la uretra),
  • Saliva
  • Cum
  • Jugo de próstata,
  • Tejidos placentarios y líquido amniótico (líquido amniótico),
  • Sedimento de orina (después de la centrifugación), por ejemplo, para detectar algunas ITS y Mycobacterium tuberculosis,
  • Esputo y líquido pleural para el mismo propósito.
  • Exudados
  • Líquido cefalorraquídeo en casos de sospecha de lesión infecciosa del sistema nervioso central,
  • Material de biopsia (biopsia), tomado del hígado, duodeno, estómago, etc.

Me gustaría agregar a lo anterior que el material para la prueba en todos los casos, incluso en raspaduras y excreciones, será suficiente, ya que la prueba del método de PCR no requiere grandes volúmenes, hay suficiente análisis y unos pocos microlitros, que generalmente se toman en un microtubo de tipo Eppendorf y se envían a investigacion

Reacción en cadena del VIH y la polimerasa.

Por lo general, cuando se pasa una encuesta anónima en caso de resultados positivos de inmunotransferencia, el diagnóstico de infección por VIH se repite nuevamente. Si se confirma el diagnóstico, se prescribe al paciente estudios adicionales:

  1. Uso de reacciones inmunológicas para determinar los valores absolutos del número de linfocitos CD4 (células inmunocompetentes: ayudantes T o ayudantes), la infección afecta en primer lugar, después de lo cual pierden sus propiedades básicas y no pueden distinguir entre "su" y la de otra persona ". El ARN del virus que circula en el plasma sanguíneo se toma como las células normales del cuerpo y no reacciona a ellas,
  2. Detección del ARN del virus mediante PCR y cálculo de la concentración de partículas virales para establecer el estadio, la gravedad del proceso patológico y el pronóstico basado en estos datos.. Por supuesto, la palabra "norma" a este respecto no existe, ya que la reacción es siempre positiva y descifrar los valores numéricos es competencia del médico.

PCR y hepatitis

Los patógenos de la hepatitis C se pueden detectar por PCR, la mayoría de las veces la prueba se usa para diagnosticar la hepatitis C, que se detecta de manera deficiente por otros métodos.

El virus de la hepatitis C (que contiene ARN) en su comportamiento en el cuerpo humano se parece al VIH. Ingresando en el genoma de las células hepáticas (hepatocitos), permanece allí esperando su hora, que puede llegar después de 2 años, al menos 20 años, por lo que los médicos lo llamaron "un asesino suave". La hepatitis C conduce a la formación de un proceso maligno en el parénquima hepático, que se manifiesta en las etapas posteriores. El sistema inmunológico no nota todos estos eventos, tomando el virus por un hepatocito. Es cierto que se producen anticuerpos contra el virus en algunas cantidades, pero no proporcionan una respuesta inmune decente. Para el diagnóstico de ELISA para la hepatitis C no es muy informativo, ya que indica que el virus dejó rastros, y se desconoce si él mismo dejó. En el VHC se conocen casos de autocuración, mientras que los anticuerpos contra el virus permanecen y continúan circulando de por vida (memoria inmunológica). PCR significativamente antes de la formación de anticuerpos y puede detectar una partícula viral después de 1-1.5 semanas, mientras que los anticuerpos pueden aparecer en el rango de 2 meses a seis meses

El diagnóstico por PCR en caso de sospecha de un atracón del virus de la hepatitis C en el cuerpo humano es el método más óptimo de investigación, ya que solo es capaz de reconocer la presencia de un "enemigo sensible" en la biopsia de sangre o hígado del paciente.

Sin embargo, a veces hay casos en que los AT son positivos y el resultado de la PCR es negativo. Esto sucede a veces con una cantidad muy baja de virus o cuando está "latente" en el hígado sin entrar en el torrente sanguíneo. Para encontrar la verdad, el paciente se vuelve a analizar, o incluso más de uno.

Infección del virus del papiloma humano

El VPH (virus del papiloma humano), si no se produce la autocuración, también puede, sin manifestarse, persistir durante mucho tiempo en el cuerpo del huésped, lo que ni siquiera se sospecha al respecto, ya que no se realizó la PCR y los síntomas estaban ausentes. Sin embargo, la presencia de infección por virus del papiloma humano, aunque latente, dista mucho de ser indiferente a la salud humana, donde ciertos tipos de virus que causan cáncer son particularmente peligrosos (tipos 16, 18).

Más a menudo, la mitad femenina de la población sufre de VPH, ya que el virus ama más a los genitales femeninos, y especialmente al cuello uterino, donde algunos tipos de virus contribuyen al desarrollo de procesos displásicos, y luego al cáncer cervical, si no trata la displasia y le da rienda suelta al virus. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

Las infecciones por TORCH y las ITS están tan interrelacionadas que a veces es difícil determinar a qué grupo debe asignarse un patógeno en particular. En general, son difíciles de entender, ya que son grupos muy diversos de microorganismos que siempre pueden transmitirse sexualmente o solo bajo ciertas condiciones (inmunodeficiencia), y pueden ser de interés solo durante el embarazo, debido al posible impacto negativo en su curso y en el feto.

PCR: el principal método para detectar infecciones ocultas

El desarrollo de las manifestaciones clínicas se basa en varios patógenos, que solo se pueden encontrar mediante PCR, que es su tarea principal, a veces conjuntamente con ELISA, y otras veces como la única prueba confirmatoria, especialmente si los síntomas de la enfermedad están ausentes. Una situación tan difícil puede crear una infección polimicrobiana que, además de los agentes causales evidentes, también incluye patógenos oportunistas.

En los hombres que sufren enfermedades inflamatorias de la esfera genital, por ejemplo, a menudo se detectan uretritis, clamidia, ureaplasma y micoplasma. Estos mismos tipos son peligrosos y el cuerpo femenino. Aquellos que conocen la perfidia de la clamidia y la han encontrado seguramente recordarán lo difícil que es encontrarla y reconocerla, por lo tanto, el análisis realizado por PCR en la clamidia es especialmente confiable, porque el parásito que se esconde en una célula de dimensiones muy pequeñas se comporta con cuidado y siempre perjudica subrepticiamente

Ureaplasma a menudo se considera emparejado con micoplasma. Y esto no es un accidente. Estas especies, como la clamidia, no son virus ni bacterias, viven dentro de las células y pertenecen a las ITS, aunque su presencia en un organismo sano también está lejos de ser poco común. Por lo tanto, para distinguir un portador sano de una persona enferma, se necesitan métodos especiales donde la PCR se considera la más confiable, ya que, debido a la naturaleza de la estructura y el comportamiento de estos microorganismos, otros estudios son ineficaces.

En cuanto al virus del herpes (tipo 1, 2) y el citomegalovirus, que también pertenece al virus del herpes (tipo 5), la situación aquí también es ambigua. La infección de la población mundial se acerca al 100%, por lo que en este caso, la identificación del virus y su dosis es muy importante, lo que juega un papel importante durante el embarazo, ya que un adulto que ha echado raíces en su cuerpo a menudo no causa ningún problema y no da señales de la enfermedad.

Por lo tanto, un examen similar recetado por un médico no debe ser ignorado, porque en algunos casos la reacción en cadena de la polimerasa es un método indispensable y necesario de diagnóstico de laboratorio que puede proteger no solo a una mujer, sino también a una persona pequeña, no nacida, de complicaciones graves.

En conclusión, me gustaría señalar que un método tan maravilloso, como el PCR, ha servido a la humanidad durante más de 30 años. Al mismo tiempo, las tareas de la prueba no se limitan a la búsqueda de patógenos de enfermedades infecciosas. La reacción en cadena de la polimerasa, nacida sobre la base de la biología molecular, está inseparablemente vinculada con la genética, Usado exitosamente en medicina forense para identificación personal., en medicina forense para el establecimiento de la paternidad, en medicina veterinaria, si la clínica para animales tiene la oportunidad de adquirir equipos costosos, así como en otras áreas (industria, agricultura, etc.).

La esencia del método de diagnóstico por PCR.

Análisis por PCR: ¿qué es y cómo funciona? La esencia del método consiste en utilizar una enzima ADN polimerasa especial in vitro para aumentar el volumen de un determinado entorno microbiano. Para ello, multiplica el material de ADN disponible. Por lo tanto, en presencia de un microorganismo patógeno en la muestra, su cantidad aumentará debido a las manipulaciones bioquímicas de laboratorio, y la bacteria no será difícil de detectar en un microscopio.

¿Cómo es el material de investigación?

Para el análisis requerido:

  • Matriz de ADN
  • Imprimaciones que conectan los extremos de una pieza de material.
  • enzima polimerasa de ADN resistente al calor,
  • Los químicos que hacen que las enzimas funcionen correctamente.
  • Solución tampón necesaria para crear las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo del material de ADN.

Para realizar la PCR, realice 25-30 repeticiones, que constan de tres etapas: desnaturalización, recocido y elongación.

Para el análisis de la reacción en cadena de polimezar utilizando un dispositivo especial: el amplificador. El equipo moderno le permite instalar el programa necesario de tubos de calefacción y refrigeración para eliminar los errores durante el diagnóstico.

¿Dónde se aplica el diagnóstico?

El método de reacción en cadena de polymezare se utiliza en varios campos de la medicina:

  • los criminólogos lo utilizan para identificar material genético, como cabello, saliva o sangre,
  • Un análisis de sangre de PCR ayuda con el genotipado, por ejemplo, para detectar una reacción individual genéticamente incorporada a un medicamento específico,
  • Utilizando este método, se establece la existencia de parentesco entre personas.
  • El método de PCR más popular se ha convertido en el diagnóstico médico para la determinación de diversas enfermedades infecciosas.

¿Qué infecciones revela la PCR?

Entonces, la medicina ha usado por mucho tiempo y con éxito el análisis de la PCR. Lo que es, ya lo hemos aprendido. ¿Y qué patógenos se pueden detectar con él? Las siguientes enfermedades infecciosas son diagnosticadas por PCR:

  • Hepatitis A, B, C,
  • ureaplasmosis
  • candidiasis
  • clamidia
  • micoplasmosis
  • Gardnerelosis
  • mononucleosis infecciosa,
  • tricomoniasis
  • infección por virus del papiloma humano
  • tuberculosis
  • Infección por herpes de los tipos 1 y 2.
  • helicobacteriosis,
  • citomegalovirus,
  • difteria
  • salmonela
  • Infeccion por VIH

Además, los métodos de PCR se utilizan en el diagnóstico de cáncer.

Ventajas del método.

El diagnóstico de la PCR tiene varias ventajas:

  1. Alta sensibilidad. Incluso con solo unas pocas moléculas de ADN de un microorganismo, el análisis de PCR determina la presencia de infección. Ayudará el método para enfermedades crónicas y latentes. A menudo, en tales casos, el microorganismo no se cultiva por otros medios.
  2. Cualquier material es adecuado para la investigación, por ejemplo, saliva, sangre, secreciones genitales, pelo, células epiteliales. El más común es un análisis de sangre y un frotis urogenital en la PCR.

Recomendaciones para la preparación para el análisis.

Para que los resultados sean confiables al realizar un estudio de PCR, es necesario pasar el análisis, siguiendo las recomendaciones sobre la preparación preliminar para el diagnóstico:

  1. Antes de la entrega de saliva debe abstenerse de comer alimentos y medicamentos durante 4 horas antes de la recolección del material. Inmediatamente antes del procedimiento, enjuague su boca con agua hervida.
  2. Se deben seguir las reglas anteriores al tomar una muestra desde el interior de la mejilla. Después del enjuague, se recomienda realizar un ligero masaje de la piel para resaltar el secreto de la glándula.
  3. La orina suele recogerse en casa. Para ello es necesario mantener un aseo cuidadoso de los genitales. En un recipiente de plástico estéril, deben recogerse 50-60 ml de orina. Para garantizar la pureza del material, se recomienda que las mujeres inserten un tampón en la vagina y que los hombres tiren del pliegue de la piel tanto como sea posible. No se puede pasar el material durante el período menstrual.
  4. Para donar esperma debe abstenerse de tener relaciones sexuales durante 3 días antes de tomar el material. Además, los médicos recomiendan no ir a la sauna y tomar un baño caliente, beber alcohol y comidas picantes. 3 horas antes del análisis debe abstenerse de orinar.
  5. Para la administración de un frotis urogenital, por ejemplo, si se está analizando la PCR para clamidia, se recomienda que tanto las mujeres como los hombres tengan descanso sexual durante 3 días. 2 semanas antes del análisis no se pueden tomar medicamentos antibacterianos. Durante una semana debe dejar de usar geles íntimos, ungüentos, supositorios vaginales, duchas. 3 horas antes de la prueba, debe abstenerse de orinar. Durante la menstruación, el material no se recoge, solo 3 días después del cese de la descarga de sangre, se puede tomar un frotis urogenital.

PCR durante el embarazo

Mientras se espera a un bebé, muchas infecciones de transmisión sexual son extremadamente peligrosas para el desarrollo normal del feto. Las ETS pueden provocar retraso en el crecimiento intrauterino, aborto espontáneo o nacimiento prematuro, y malformaciones congénitas de un niño. Por lo tanto, es extremadamente importante someterse a un examen de PCR en el embarazo temprano. Para pasar el análisis es necesario para el registro - hasta 12 semanas.

El material se toma del canal cervical con un cepillo especial. El procedimiento es indoloro y no representa un peligro para el bebé. Por lo general, durante el embarazo, la clamidia se analiza mediante el método de PCR, así como mediante ureaplasmosis, micoplasmosis, citomegalovirus, herpes, papilomavirus. Una encuesta tan compleja llamada PCR-6.

PCR para diagnóstico de VIH

Debido al hecho de que la reacción en cadena de la polimerasa es muy sensible a los cambios en el cuerpo y las condiciones de diagnóstico, muchos factores pueden afectar el resultado. Por lo tanto, el análisis de PCR para la infección por VIH no es un método confiable, su efectividad es de 96 a 98%. En el restante 2-4% de los casos, la prueba da resultados positivos falsos.

Pero en algunas situaciones, es imposible prescindir de los diagnósticos de PCR del VIH. Por lo general, se realiza a personas con un resultado falso negativo de ELISA. Tales indicadores sugieren que una persona aún no ha desarrollado anticuerpos contra el virus y es imposible detectarlos sin un aumento múltiple en el número. Esto es lo que se puede lograr al realizar un análisis de sangre usando el método de PCR.

Este diagnóstico también es necesario para los niños del primer año de vida que nacen de una madre VIH-positiva. El método es la única forma de determinar de manera confiable el estado del niño.

PCR para el diagnóstico de hepatitis

El método de reacción en cadena de la polimerasa permite detectar el ADN de los virus de la hepatitis A, B, C mucho antes de la formación de anticuerpos contra la infección o el inicio de los síntomas de la enfermedad. El análisis de PCR para la hepatitis C es particularmente efectivo, ya que en el 85% de los casos, esta enfermedad es asintomática y llega a la etapa crónica sin tratamiento oportuno.

La detección temprana del patógeno ayudará a evitar las complicaciones y el tratamiento a largo plazo.

Examen completo de PCR

Análisis de PCR integral: ¿qué es? Esta es una reacción en cadena de la polimerasa, que involucra la identificación de varios tipos de infecciones: el tipo de la parásita, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma, el genoma de la par. El precio de estos diagnósticos oscila entre 2.000 y 3.500 rublos. Según la clínica, los materiales y equipos utilizados, así como el tipo de análisis: cualitativo o cuantitativo. Lo que se necesita en su caso - el médico decidirá. En algunos casos, basta con determinar la presencia del patógeno; en otros, por ejemplo, en el caso de una infección por VIH, el título cuantitativo desempeña un papel importante. Al diagnosticar todos los patógenos anteriores, la encuesta se denomina "análisis PCR-12".

Descifrando los resultados del análisis.

Decodificar el análisis por PCR es fácil. Solo hay 2 escalas del indicador: "resultado positivo" y "resultado negativo". Cuando se detecta un patógeno, los médicos pueden confirmar con un 99% de certeza la presencia de la enfermedad y proceder al tratamiento del paciente. En el método cuantitativo para determinar la infección en la columna correspondiente se indicará un indicador numérico de las bacterias detectadas. Solo un médico puede determinar la extensión de la enfermedad y prescribir el tratamiento necesario.

En algunos casos, por ejemplo, en la determinación de la infección por VIH por PCR, con un resultado negativo, es necesario realizar exámenes adicionales para confirmar los indicadores obtenidos.

¿A dónde llevar el análisis?

¿Dónde pasar el análisis de PCR: en la clínica pública o en un laboratorio privado? Desafortunadamente, en las instituciones médicas municipales, el equipo y los métodos a menudo están desactualizados. Por lo tanto, es mejor dar preferencia a los laboratorios privados con equipos modernos y personal altamente calificado. Además, en una clínica privada, obtendrás resultados mucho más rápido.

En Moscú, muchos laboratorios privados ofrecen análisis de PCR para diversas infecciones. Por ejemplo, en clínicas como Vita, Clínica compleja, Familia feliz, Uro-Pro, analizan la PCR. El precio de la encuesta es de 200 rublos. Para la determinación de un patógeno.

Se puede concluir que el diagnóstico de enfermedades infecciosas por PCR en la mayoría de los casos es una forma rápida y confiable de detectar el patógeno en el cuerpo en las primeras etapas de la infección. Pero sin embargo, en ciertos casos vale la pena elegir otros métodos de diagnóstico. Sólo un especialista puede determinar la necesidad de tal estudio. La decodificación del análisis de PCR también requiere un enfoque profesional. Siga las recomendaciones del médico y no tome sus propias pruebas, que no son necesarias.

Las ventajas del diagnóstico por PCR en la medicina moderna:

• Detección directa de la presencia de un patógeno (es decir, una región específica del ADN o ARN del patógeno) en la muestra en estudio.
• La alta especificidad le permite determinar una región única de ADN o ARN que es característica de un patógeno específico, lo que elimina la posibilidad de reacciones falsas.
• La alta sensibilidad del método de PCR hace posible detectar incluso células individuales de patógenos (virus, bacterias). La sensibilidad del análisis de PCR es de 10-1000 células en la muestra en estudio (por ejemplo, la sensibilidad de las pruebas inmunológicas y microscópicas es de solo 103-105 células).
• Desarrollo de un método de PCR universal para la detección de diversos patógenos. El objeto de la investigación por PCR es el material genético (ADN, ARN) del patógeno. La técnica permite identificar varios patógenos de una sola muestra biológica.
• Lo suficientemente rápido para obtener el resultado del análisis. La investigación completa se lleva a cabo en 4-4.5 horas, con menos frecuencia, un poco más.
• La posibilidad de detectar patógenos antes del inicio de los síntomas (diagnóstico preclínico) y después de la última enfermedad (diagnóstico retrospectivo). Un ejemplo de diagnóstico preclínico será el examen durante el período de incubación (desde el momento de la infección hasta que surjan las quejas del paciente), así como la infección latente (cuando no hay síntomas, solo datos de laboratorio, por ejemplo, PCR). Uno de los puntos importantes de los diagnósticos de PCR es la PCR en material de archivo o residuos biológicos, que es importante para la identificación de una persona o paternidad.

Actualmente, el diagnóstico por PCR está experimentando un desarrollo significativo. El método en sí está siendo mejorado, aparecen nuevos tipos de PCR una y otra vez, los nuevos sistemas de prueba para esta reacción están llegando al mercado médico. Debido a esto, el costo de los estudios de PCR cada año se vuelve más accesible para una amplia gama de pacientes.

¿En qué se basa el método de PCR?

La base de la reacción en cadena de la polimerasa es la duplicación (amplificación) repetida de una determinada sección de ADN o ARN con la ayuda de enzimas en el laboratorio. El resultado es la cantidad de ADN o ARN suficiente para el análisis visual. En el curso del estudio, solo se copia el área que se ajusta a las condiciones especificadas, y solo en la situación de su presencia en la muestra en estudio.

Por ejemplo, el material para el estudio, que asume la presencia de fragmentos de ADN o ARN del patógeno (saliva, sangre, orina, descarga de genitales), se coloca en un reactor especial (amplificador). A continuación, se le agregan enzimas específicas que se unen al ADN o ARN del patógeno, y se sintetiza su copia. Esta copia tiene lugar en varias etapas de un tipo de "reacción en cadena", y en última instancia, cientos y miles de copias pueden formarse a partir de una sola copia del material genético. Luego, se realiza un análisis y comparación del resultado con la base de datos existente sobre la estructura de varios patógenos. A través de la PCR, es posible no solo identificar el tipo de patógeno, sino también producir un resultado cuantitativo del análisis, es decir, cuántos patógenos hay en el cuerpo humano.

El método de PCR actualmente está ampliando el rango de oportunidades de investigación: introduciendo mutaciones, empalmando fragmentos de ADN, y se usa ampliamente en medicina, por ejemplo, para establecer la paternidad, la aparición de nuevos genes, etc.

Qué infecciones se pueden detectar mediante el diagnóstico por PCR

1) Infección por VIH (puede detectar el virus de inmunodeficiencia humana VIH-1)
2) Hepatitis viral A, B, C, G (ARN-HAV, ADN-VHB, ARN-VHC, ARN-HGV)
3) Mononucleosis infecciosa (ADN del virus de Epstein-Barr-VEB)
4) Infección por citomegalovirus (ADN-CMV)
5) Infección por herpes (ADN del herpes simple - HSV tipo 1 y 2)
6) ITS (infecciones de transmisión sexual): ureaplasmosis, gardnerelosis, clamidia, micoplasmosis, tricomoniasis,
7) Tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis)
8) Virus oncogénicos: infección por el virus del papiloma humano (virus del papiloma humano (incluida su especie oncogénica 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 y 59)
9) Borreliosis, encefalitis transmitida por garrapatas
10) Listeriosis
11) Candida (hongos del género Candida)
12) Infección por Helicobacter pylori (Helicobacter pylori)
y otros

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

El examen de las infecciones de transmisión sexual (ITS) en hombres y mujeres implica secreciones de los genitales, un frotis o raspado del cuello uterino, un frotis o raspado de la uretra (uretra), orina.

Cuando se examinan infecciones (herpes, CMVI, mononucleosis, toxoplasmosis, hepatitis B, C, infección por VIH), la sangre se recoge en la PCR.

Para el diagnóstico de mononucleosis infecciosa, CMV, herpes, frotis de garganta, y para la prueba de orina para CMV. A menudo, para el examen de las lesiones del sistema nervioso, varios estudios recolectan líquido cefalorraquídeo.

En neumología, el material es el esputo, el líquido pleural.

Al examinar infecciones intrauterinas - líquido amniótico, tejido placentario.

Preparación para la entrega del material y el diagnóstico por PCR.

Casi todos los pacientes que se someten a un diagnóstico de PCR tienen derecho a confiar en resultados fiables, precisos y rápidos, que dependen en gran medida de la capacidad del laboratorio y de la profesionalidad del técnico de laboratorio. Al mismo tiempo, muchas personas no creen que esta misma confiabilidad dependa en muchos aspectos de nosotros mismos, es decir, de las recomendaciones del médico a cargo, la forma de vida y la exactitud del muestreo del material. Al tomar el material, se requieren condiciones que excluyan la contaminación (contaminación) del material y, en consecuencia, cuestionen la objetividad del análisis.

La preparación adecuada para la entrega del material no es particularmente difícil. Existen las siguientes recomendaciones médicas para pacientes:

1) No tener vida sexual el día anterior a la entrega del material,
2) la sangre para investigación se rinde por la mañana con el estómago vacío (no comer, no beber),
3) Después de la administración de la orina, la primera porción de la mañana se recoge en un recipiente limpio y estéril.

Explicación de los resultados de la PCR

Negativo El resultado de la PCR indica que no se encontraron rastros de agentes infecciosos en el material en estudio en el momento del parto. La mayoría de los casos muestran la ausencia de infección, que intentaron encontrar en la prueba.

Positivo El resultado de la PCR indica la detección de trazas de infección en la muestra biológica en estudio. Con gran precisión, un resultado positivo indica la presencia de una infección en un momento dado en el tiempo.

Hay situaciones en las que la PCR es positiva y es imposible hablar sobre una infección activa; este es el llamado "estado de portador sano" sin síntomas clínicos de la enfermedad, que no requiere tratamiento, pero requiere la observación dinámica de un médico. Se observa con más frecuencia en una serie de infecciones virales (HPV, CMVI, EBV, herpes, etc.) en materiales como la saliva, el raspado del canal cervical, la uretra, es decir, desde el enfoque local. Sin embargo, no debemos olvidar que la transmisión de portadores a personas sanas es posible, como lo es la transición a la forma crónica de la enfermedad con el proceso de activación. Si la PCR es positiva en la sangre, ya no es un estado portador y requiere un tratamiento específico.

El resultado cuantitativo de la PCR solo es evaluado por un médico individualmente para detectar una infección por separado y no tiene gradaciones comunes. Sobre la base del resultado cuantitativo de la PCR, el médico puede determinar el grado de actividad de la infección y establecer el estadio de la enfermedad, lo que ciertamente afectará el curso y las dosis de los medicamentos recetados.

Una de las últimas preguntas interesantes: ¿qué tan preciso es el diagnóstico de PCR?

Para el análisis de PCR, hay 3 definiciones:

1. Precisión (con una alta probabilidad de posible detección o ausencia de infección).
2. Especificidad (exactitud de detección de una infección específica).
3. Sensibilidad (incluso con un bajo contenido de material genético de patógenos en la muestra en estudio, se detectará la infección).

La reacción de la cadena de polimerasa casi no produce resultados falsos positivos (es decir, no hay muestras positivas donde no hay infección). Los resultados falsos negativos rara vez se observan (más a menudo se asocia con la ausencia de infección activa en una persona en este momento). Por ejemplo, infección latente, infección crónica fuera de actividad.

El contenido

A principios de la década de 1970, el científico noruego Kjell Kleppe, del laboratorio del premio Nobel Khara Gobinda Quran, propuso un método para amplificar el ADN utilizando un par de moléculas cortas de ADN monocatenario: cebadores sintéticos [1]. Sin embargo, en ese momento esta idea seguía sin cumplirse. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Carey Mullis [2] [3]. Su objetivo era crear un método que permitiera la amplificación del ADN en el curso de múltiples duplicaciones sucesivas de la molécula de ADN original utilizando la enzima ADN polimerasa. La primera publicación sobre el método de PCR apareció en noviembre de 1985 en la revista Science [4]. El método revolucionó la biología molecular y la medicina. En 1993, Carey Mullis recibió el Premio Nobel de Química por esto. [5].

Al comienzo del uso del método, después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, se debía agregar la ADN polimerasa a la mezcla de reacción, ya que se inactivaba a la alta temperatura necesaria para la separación de las cadenas de hélice del ADN. El procedimiento de reacción fue relativamente ineficiente, demandando mucho tiempo y enzima. En 1986, el método de reacción en cadena de la polimerasa mejoró significativamente. Se propuso utilizar ADN polimerasas de bacterias termófilas [6]. Estas enzimas eran termoestables y podían soportar muchos ciclos de reacción. Su uso ha permitido simplificar y automatizar el PCR. Una de las primeras ADN polimerasas termoestables fue aislada de bacterias. Thermus aquaticus y nombrado Taq-polimerasa. La desventaja de esta polimerasa es la probabilidad bastante alta de introducir un nucleótido erróneo, ya que esta enzima no tiene mecanismos para corregir errores (actividad 3 '→ 5'-exonucleasa). Polimerasa Pfu y Pwo, aislados de las arqueas, tienen este mecanismo, su uso reduce significativamente el número de mutaciones en el ADN, pero su velocidad (procesividad) es menor que la de Taq. Ahora aplica la mezcla Taq y Pfupara lograr simultáneamente una alta velocidad de curado y una alta precisión de copia.

En el momento de la invención del método, Carey Mullis trabajaba como químico sintético (sintetizó oligonucleótidos, que luego se usaron para identificar mutaciones puntuales mediante hibridación con ADN genómico) en Cetus (Cetus Corporation), que patentó el método de PCR. En 1992, Cetus vendió los derechos del método y la patente para usar TaqEmpresa de polimerasa Hofman-La Roche por $ 300 millones. Sin embargo, resultó que TaqLa polimerasa se caracterizó por los bioquímicos soviéticos A. Kaledin, A. Slusarenko y S. Gorodetsky en 1980 [7], y 4 años antes de esta publicación soviética, es decir, en 1976, por la bioquímica estadounidense Alice Chien, David B. Edgar y John M. Trela. [8] En este sentido, la compañía Promega intentó en una orden judicial obligar a Rosh a renunciar a los derechos exclusivos de esta enzima [9]. Una patente estadounidense para la PCR expiró en marzo de 2005.

El método se basa en la copia selectiva repetida de una determinada sección de ácido nucleico de ADN con la ayuda de enzimas en condiciones artificiales (in vitro). Cuando esto sucede, solo se copia el área que cumple con las condiciones especificadas, y solo si está presente en la muestra en estudio. A diferencia de la amplificación de ADN en organismos vivos (replicación), las secciones relativamente cortas de ADN se amplifican mediante PCR. En un proceso de PCR convencional, la longitud de las secciones de ADN a copiar no es más de 3000 pares de bases (3 kbp [10]). Usando una mezcla de diferentes polimerasas, con el uso de aditivos y bajo ciertas condiciones, la longitud del fragmento de PCR puede alcanzar 20-40 mil pares de bases. Todavía es significativamente menor que la longitud del ADN cromosómico de la célula eucariota. Por ejemplo, el genoma humano consta de unos 3 mil millones de pares de bases [11].

Componentes de reacción Editar

En el caso más simple, se requieren los siguientes componentes para la PCR:

  • Matriz de ADNContiene el ADN que necesita ser amplificado.
  • Dos primersComplementario a los extremos opuestos de las diferentes cadenas del fragmento de ADN deseado.
  • Termoestable ADN polimerasa - Una enzima que cataliza una reacción de polimerización de ADN. La polimerasa para uso en la PCR debe permanecer activa a altas temperaturas durante mucho tiempo, por lo tanto, las enzimas aisladas de los termófilos se utilizan: Thermus aquaticus (Taq-polimerasa), Pyrococcus furiosus (Pfu-polimerasa), Pyrococcus woesei (Pwo-polimerasa), Thermus thermophilus (Tthpolimerasa) y otros.
  • Desoxirribonucleósidos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Iones Mg2 + requeridos para la operación de la polimerasa.
  • Solución tampónproporcionando las condiciones de reacción necesarias - pH, fuerza iónica de la solución. Contiene sal, albúmina de suero bovino.

Para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, se agrega al tubo un aceite de alto punto de ebullición, por ejemplo, aceite de vaselina. Si se utiliza una tapa de calentamiento, esto no es necesario.

La adición de pirofosfatasa puede aumentar el rendimiento de la reacción de PCR. Esta enzima cataliza la hidrólisis del pirofosfato, un subproducto de la adición de nucleótido trifosfatos a una cadena de ADN en crecimiento, a ortofosfato. El pirofosfato puede inhibir la reacción de PCR [12].

Primers Editar

La especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre la matriz y los cebadores, oligonucleótidos sintéticos cortos de 18-30 bases de longitud. Cada uno de los cebadores es complementario de una de las cadenas de la matriz de doble cadena y limita el principio y el final de la región amplificada.

Después de la hibridación de la matriz con el cebador (recocido [13]), este último sirve como cebador para la ADN polimerasa durante la síntesis de la cadena complementaria de la matriz (ver más abajo).

La característica más importante de los cebadores es el punto de fusión (Tma) matriz-cebador complejo.

Tm - la temperatura a la que la mitad de la plantilla de ADN forma un complejo con un cebador de oligonucleótido. Fórmula de conteo promediada Tm para un oligonucleótido corto (y para fragmentos de ADN largos), teniendo en cuenta la concentración de iones K + y DMSO:

donde L es el número de nucleótidos en el cebador, K + es la concentración molar de iones de potasio, G + C es la suma de todas las guaninas y citosinas.

En el caso de una elección incorrecta de la longitud y la composición de nucleótidos del cebador o la temperatura de hibridación, es posible la formación de complejos parcialmente complementarios con otras regiones del ADN plantilla, lo que puede conducir a la aparición de productos no específicos. El límite superior del punto de fusión está limitado por la temperatura óptima de la polimerasa, cuya actividad cae a temperaturas superiores a 80 ° C.

Al elegir los cebadores, es conveniente cumplir con los siguientes criterios:

40—60 %,

  • cerrar tm cebadores (diferencias no superiores a 5 ° C),
  • la ausencia de estructuras secundarias no específicas - horquillas [15] y dímeros [16],
  • Es deseable que la guanina o la citosina estén presentes en el extremo 3 ', ya que forman tres enlaces de hidrógeno con la molécula de la matriz, lo que hace que la hibridación sea más estable.
  • Edición de amplificador

    PCR se realiza en termociclador - un dispositivo que proporciona enfriamiento y calentamiento periódicos de los tubos, generalmente con una precisión de al menos 0,1 ° C. Los amplificadores modernos le permiten configurar programas complejos, incluida la posibilidad de "arranque en caliente", Touchdown PCR (ver más abajo) y el posterior almacenamiento de las moléculas amplificadas a 4 ° C. Para la PCR en tiempo real, se producen instrumentos equipados con un detector fluorescente. También hay dispositivos con una tapa automática y un compartimento para microplacas, que les permite integrarse en sistemas automatizados.

    Normalmente, se realizan 20 a 35 ciclos durante la PCR, cada uno de los cuales consta de tres etapas (Fig. 2).

    Desnaturalización Editar

    La plantilla de ADN de doble cadena se calienta a 94–96 ° C (o hasta 98 ​​° C, si se usa una polimerasa termoestable particularmente estable) durante 0,5–2 min, de modo que las cadenas de ADN se separan. Esta etapa se llama fusión (desnaturalización, porque los enlaces de hidrógeno entre dos cadenas de ADN se destruyen. Por lo general, antes del primer ciclo, se lleva a cabo un largo calentamiento de la mezcla de reacción durante 2 a 5 minutos para desnaturalizar completamente la plantilla y los cebadores.

    Recocido Editar

    Cuando las cadenas se separan, la temperatura se reduce para que los cebadores puedan unirse a la matriz de una sola hebra. Esta etapa se llama recocido. La temperatura de recocido depende de la composición del cebador y generalmente se elige 5 grados más bajo que el punto de fusión de los cebadores. La elección incorrecta de la temperatura de recocido conduce a una unión deficiente de los cebadores a la matriz (a temperatura elevada), oa una unión en el lugar equivocado y a la aparición de productos no específicos (a baja temperatura). El tiempo de la etapa de recocido es de 30 segundos. Al mismo tiempo, durante este tiempo, la polimerasa ya tiene tiempo para sintetizar varios cientos de nucleótidos. Por lo tanto, se recomienda seleccionar cebadores con un punto de fusión por encima de 60 ° C y llevar a cabo el recocido y el alargamiento simultáneamente, a 60-72 ° C.

    Elongación Editar

    La ADN polimerasa replica la hebra de la plantilla utilizando el cebador como semilla. Esta es la etapa alargamiento. La polimerasa comienza la síntesis de la segunda cadena desde el extremo 3 'del cebador que está asociado con la matriz, y se mueve a lo largo de la matriz, sintetizando una nueva cadena en la dirección desde el extremo 5' hasta el extremo 3 '. La temperatura de alargamiento es dependiente de la polimerasa. Polimerasas de uso frecuente Taq y Pfu Más activo a 72ºC. El tiempo de alargamiento depende tanto del tipo de ADN polimerasa como de la longitud del fragmento amplificado. Por lo general, el tiempo de alargamiento es igual a un minuto por cada mil pares de bases. Después del final de todos los ciclos, a menudo se lleva a cabo una etapa adicional. alargamiento finalpara completar todos los fragmentos de una sola cadena. Esta etapa dura de 7 a 10 minutos.

    La cantidad de un producto de reacción específico (limitado por los cebadores) aumenta teóricamente en proporción a 2 n - 2n, donde n es el número de ciclos de reacción [17]. De hecho, la eficiencia de cada ciclo puede ser inferior al 100%, por lo que en realidad P

    (1 + E) n, donde P es la cantidad del producto, E es la eficiencia promedio del ciclo.

    El número de copias "largas" de ADN también está creciendo, pero de forma lineal, por lo que un fragmento específico domina en los productos de reacción.

    El crecimiento del producto requerido en la progresión geométrica está limitado por la cantidad de reactivos, la presencia de inhibidores, la formación de subproductos. En los últimos ciclos de la reacción, el crecimiento se ralentiza, lo que se denomina "efecto de meseta".

    • RPA (Amplificación de la polimerasa de la recombinasa inglesa - Amplificación de la polimerasa de la recombinasa): se utiliza cuando se requiere la amplificación del ADN / ARN durante 15 minutos sin termociclador (reacción isotérmica) [18] [19]
    • PCR anidada (PCR anidada (Eng.)): Se utiliza para reducir el número de subproductos de la reacción. Se utilizan dos pares de cebadores y se realizan dos reacciones sucesivas. El segundo par de cebadores amplifica una región de ADN dentro del producto de la primera reacción.
    • PCR invertida (PCR inversa (Eng.)): Se utiliza si solo se conoce una pequeña parte dentro de la secuencia deseada. Este método es especialmente útil cuando es necesario determinar secuencias adyacentes después de la inserción del ADN en el genoma. Para la implementación de la PCR invertida, se realiza una serie de corte de ADN con restrictasas, seguido de la conexión de los fragmentos (ligadura). Como resultado, los fragmentos conocidos aparecen en ambos extremos de la región desconocida, después de lo cual la PCR se puede realizar como de costumbre.
    • PCR con transcripción inversa (PCR de transcripción inversa, RT-PCR (inglés)): se utiliza para amplificar, aislar o identificar una secuencia conocida de una biblioteca de ARN. Antes de la PCR convencional, se sintetiza una molécula de ADN monocatenaria en la plantilla de ARNm usando revertasa y se obtiene un ADNc monocatenario, que se utiliza como plantilla para la PCR. Este método a menudo determina dónde y cuándo se expresan estos genes.
    • PCR asimétrica (PCR asimétrica en inglés): se realiza cuando se necesita amplificar principalmente una de las cadenas del ADN original. Utilizado en algunos ensayos de secuenciación e hibridación. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, excepto que uno de los cebadores se toma en gran exceso. Las modificaciones de este método es el inglés.Linear-UndespuésThe-EPCR exponencial (LATE-PCR), que utiliza cebadores con diferentes concentraciones, y se elige un cebador de baja concentración con un mayor (punto de fusión) que un cebador de alta concentración. La PCR se lleva a cabo a una alta temperatura de recocido, por lo que es posible mantener la eficiencia de la reacción a lo largo de todos los ciclos [20].
    • PCR cuantitativa (PCR cuantitativa, Q-PCR (inglés)) o PCR en tiempo real - utilizado para la observación directa de la medición de la cantidad de un producto de PCR específico en cada ciclo de reacción. Este método utiliza cebadores marcados con fluorescencia o sondas de ADN para medir con precisión la cantidad del producto de reacción a medida que se acumula, o se usa un colorante intercalante fluorescente. Sybr green i (pero mejor usar SYTO 13), que se une al ADN de doble cadena. Sybr green i proporciona una opción simple y económica para detectar y cuantificar productos de PCR durante la PCR en tiempo real sin la necesidad de sondas o cebadores fluorescentes específicos. Durante el tinte de amplificación. SYBR verde I se inserta en el surco menor del ADN de los productos de PCR y emite una señal fluorescente, más fuerte que la de un colorante sin unir, cuando se irradia con un láser azul. SYBR verde I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Los primeros ciclos se llevan a cabo a una temperatura superior a la temperatura óptima de recocido, luego, cada varios ciclos, la temperatura de recocido se reduce gradualmente a la óptima. Esto se hace para garantizar que el cebador se hibride con la cadena complementaria a lo largo de toda su longitud, mientras que a la temperatura óptima de recocido, el cebador se hibrida parcialmente con la cadena complementaria. La hibridación parcial de un cebador en el ADN genómico conduce a una amplificación no específica, si existen bastantes sitios de unión para el cebador. En la mayoría de los casos, los primeros diez ciclos de PCR pueden llevarse a cabo a una temperatura de recocido de 72-75 ° C y luego reducirse inmediatamente a óptimo, por ejemplo, a 60-65 ° C.
    • Método de la colonia molecular (PCR in gel, English Colony - PCR Colony) - polimerización en gel de acrilamida con todos los componentes de la PCR en la superficie y realizar la PCR. En los puntos que contienen el ADN analizado, la amplificación se produce con la formación de colonias moleculares.
    • PCR con rápida amplificación de los extremos del ADNc. (Nació la amplificación rápida de los extremos del cDNA, RACE-PCR).
    • PCR de fragmentos largos (ing. PCR de largo alcance): modificación de la PCR para amplificación de regiones de ADN extendidas (10 mil o más bases). Use una mezcla de dos polimerasas, una de las cuales Taq-polimerasa con alta procesividad (que es capaz de sintetizar una cadena larga de ADN en una pasada), y la segunda es una ADN polimerasa con actividad 3'-5'-exonucleasa, generalmente polimerasa Pfu. La segunda polimerasa es necesaria para corregir los errores introducidos primero, ya que TaqLa polimerasa detiene la síntesis de ADN si se ha agregado un nucleótido no complementario. Este nucleótido no complementario elimina la polimerasa Pfu. Se toma una mezcla de polimerasas en una proporción de 50: 1 o incluso menos de 100: 1, donde TaqLa polimerasa se toma de 25 a 100 veces más que Pfupolímeros
    • Rapido (Ing. Amplificación aleatoria de ADN polimórfico), PCR con amplificación aleatoria de ADN polimórfico: se usa cuando es necesario distinguir organismos similares en secuencia genética, por ejemplo, diferentes variedades de plantas cultivadas, razas de perros o microorganismos estrechamente relacionados. En este método, usualmente se usa un cebador pequeño (aproximadamente 10 pb). Este cebador será parcialmente complementario a las regiones de ADN aleatorias de los organismos estudiados. Seleccionando las condiciones (longitud del cebador, su composición, temperatura, etc.), es posible lograr una diferencia satisfactoria en el patrón de PCR para los dos organismos.
    • PCR específica de grupo (PCR específica del grupo): PCR para secuencias relacionadas dentro de una o entre diferentes especies usando cebadores conservativos para estas secuencias. Por ejemplo, selección de cebadores universales para genes ribosómicos. 18s y 26s para la amplificación de un espaciador intergénico específico de especie: secuencia génica 18s y 26s conservador entre especies, por lo tanto, la PCR entre estos genes se realizará para todas las especies estudiadas. Lo contrario de este método es PCR única (ing. PCR única), donde la tarea es seleccionar cebadores para amplificar solo una secuencia de todos los relacionados.
    • PCR usando arranque en caliente (PCR de inicio en inglés): modificación de la PCR mediante ADN polimerasa, en la que la actividad de la polimerasa se bloquea a temperatura ambiente con anticuerpos o pequeñas moléculas del tipo Affibody que imitan a los anticuerpos, es decir, al momento de configurar la reacción antes de la primera desnaturalización en la PCR. Típicamente, la primera desnaturalización se lleva a cabo a 95 ° C durante 10 minutos.
    • PCR virtual (ing. in silico PCR, PCR digital, PCR electrónica, e-PCR) es un método matemático de análisis computacional de una reacción en cadena de polimerasa teórica que utiliza una lista de secuencias de cebadores (o sondas de ADN) para predecir la amplificación potencial del ADN del genoma, cromosoma, ADN circular o Cualquier otra pieza de ADN.

    Si la secuencia de nucleótidos de la plantilla es parcial o desconocida, puede usar cebadores degeneradoscuya secuencia contiene posiciones degeneradas en las cuales se puede ubicar cualquier base. Por ejemplo, la secuencia del cebador puede ser: ... ATH ...donde H es A, T o C.

    La PCR se utiliza en muchas áreas para el análisis y en experimentos científicos.

    Edición Forense

    La PCR se utiliza para comparar las llamadas "huellas genéticas". Se necesita una muestra del material genético de la escena del crimen (sangre, saliva, semen, cabello, etc.) que se compara con el material genético del sospechoso. Una cantidad muy pequeña de ADN es suficiente, teóricamente, una copia. El ADN se escinde en fragmentos, luego se amplifica por PCR. Los fragmentos son separados por electroforesis de ADN. El patrón resultante de la disposición de las bandas de ADN se llama huella genética (ing. huella genética).

    Diagnóstico médico Editar

    La PCR permite acelerar significativamente y facilitar el diagnóstico de enfermedades hereditarias y virales. El gen deseado se amplifica por PCR utilizando cebadores apropiados, y luego se secuencia para determinar mutaciones. Las infecciones virales pueden detectarse inmediatamente después de la infección, semanas o meses antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad.

    Medicina personalizada

    A veces las drogas son tóxicas o alergénicas para algunos pacientes. Las razones de esto se deben en parte a las diferencias individuales en la susceptibilidad y el metabolismo de los fármacos y sus derivados. Estas diferencias se determinan a nivel genético. Por ejemplo, en un paciente, un determinado citocromo (proteína hepática, responsable del metabolismo de sustancias extrañas) puede ser más activo, en otro, menos. Para determinar qué tipo de citocromo tiene este paciente, se propone realizar un análisis de PCR antes de usar el medicamento. El fuente no especificada 3300 días ] Este análisis se denomina genotipado preliminar (genotipado prospectivo en inglés).

    Clonación de genes

    La clonación de genes (que no debe confundirse con la clonación de organismos) es el proceso de aislar genes y, como resultado de manipulaciones de ingeniería genética, obtener una gran cantidad del producto de un gen determinado. La PCR se utiliza para amplificar un gen, que luego se inserta en vector - Fragmento de ADN que porta un gen extraño en el mismo u otro, conveniente para el cultivo, organismo. Como vectores, por ejemplo, se utilizan plásmidos o ADN viral. La inserción de genes en un organismo extraño generalmente se usa para obtener el producto de este gen, el ARN o, más a menudo, la proteína. Así, en cantidades industriales, muchas proteínas se obtienen para uso en agricultura, medicina, etc.

    Secuenciación de ADN

    En el método de secuenciación que utiliza un isótopo radiactivo marcado o radioactivo de dideoxinucleótidos, la PCR es una parte integral, ya que es durante la polimerización que los nucleótidos marcados con un marcador fluorescente o radioactivo se insertan en la cadena de ADN. La adición del didesoxinucleótido a la cadena sintetizada conduce a una ruptura en la síntesis, lo que hace posible determinar la posición de nucleótidos específicos después de la separación en el gel.

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